微生物实验室标准化操作规程 无菌医疗器械注册之微生物检验注意事项 健明迪

一、目的：

本规程旨在为微生物实验室操作提供一个规范化规程；

二、适用范围：

微生物实验室；

三、责任人：

实验室、微生物检测员；

四、平安留意事项：

严厉遵照无菌操作，防止微生物污染;操作人员进入微生物实验室应先关掉紫外灯。

五、微生物实验室规范化操作规程：

1.微生物实验室应设有无菌操作间缓和冲间，无菌操作间洁净度应到达10000级，室内温度坚持在20-24℃，湿度坚持在45-60%，超净台洁净度应到达100级。

2.微生物实验室应坚持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。

3.严防一切灭菌器材和培育基污染，已污染者应中止运用。

4.微生物实验室应备有任务浓度的消毒液(75％的酒精)。

5.微生物实验室应活期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证微生物实验室的洁净度契合要求。

6.需求带入微生物实验室运用的仪器，器械，平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。

7.任务人员进入微生物实验室前，必需用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间改换公用任务服，鞋，帽子，口罩和手套(用75%的乙醇再次擦拭双手)，方可进入微生物实验室停止操作。

8.微生物实验室运用前必需翻开微生物实验室的紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并且同时翻开超净台停止吹风。操作终了，应及时清算微生物实验室，再用紫外灯辐照灭菌30分钟。

9.供试品在反省前，应坚持外包装完整，不得开启，以防污染。反省前，用75%的酒精棉球消毒外表面。

10.每次操作进程中，均应做空白对照，以反省无菌操作的牢靠性。

11.吸取菌液时，必需用吸耳球吸取，切勿直接用口接触吸管。

12.接种针每次运用前后，必需经过火焰灼烧灭菌，待冷却后，方可接种培育物。

13.带有菌液的吸管，试管，培育皿于高压蒸汽灭菌锅121℃坚持20min后取出清洗。

14.如有菌液洒在桌上或地上，应立刻用75%酒精溶液覆在被污染处至少30分钟，再做处置。任务衣帽等遭到菌液污染时，应立刻脱去，高压蒸汽灭菌后洗濯。

15.凡带有活菌的物品，必需经消毒后，才干在水龙头下冲洗，严禁污染下水道。

16.微生物实验室应每月反省菌落数。在超净任务台开启的形状下，取内径90mm的无菌培育皿若干，无菌操作区分注入消融并冷却至约45℃的营养琼脂培育基约15mL，放至凝结后，倒置于30-35℃培育箱培育48小时，证明无菌后，取平板3-5个，区分放置任务位置的左中右等处，开盖表露30分钟后，倒置于30-35℃培育箱培育48小时，取出反省。100级洁净区平板杂菌数平均不得超越1个菌落，10000级洁净室平均不得超越3个菌落。如超越限制，应对微生物实验室停止彻底消毒，直至重复反省契合要求为止。

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来源：小桔灯网

作者：quite

病原微生物是指可以侵犯人体，惹起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。病原体中，以细菌和病毒的危害性*。

感染是招致人类发病和死亡的主要缘由之一，20世纪早期，抗菌药物的发现改动了现代医学，让人类有了对立感染的“武器”，也使得外科手术、器官移植和治疗癌症成为能够。但是，惹起感染性疾病的病原体种类十分多，包括病毒、细菌、真菌和其他微生物，为了提高各种疾病诊断、治疗效果，保证人们身体安康，就要求临床检验技术愈加准确、快速。那么微生物检测技术有哪些呢？

传统检测方式

对病原微生物停止传统检测的进程中，大都需求停止染色、培育，并在此基础上停止生物鉴定，以便可以鉴别不同种类的微生物，检测价值较高。传统检测方式主要包括涂片镜检、分别培育与生化反响、组织细胞培育三种。

1 涂片镜检

病原微生物体形体积庞大，大多无色半透明状，将其染色后可借助显微镜观察其大小、形状、陈列等。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形状的病原微生物感染依然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接停止图片镜检的方式反省速度较快，可以关于形状特殊的病原体停止直观的反省，不需求特殊的仪器和设备，在基层实验室里依然是十分重要的病原微生物检测手腕。

相关指南共识

《细菌与真菌涂片镜检和培育结果报告规范专家共识》

来源：中华检验医学杂志2017年1月第40卷第1期

DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.01.006

2 分别培育与生化反响

分别培育主要用于存在多种细菌时需求将其中一种细菌分别的状况，多用于痰液、粪便、血液、体液等，由于细菌生长和繁衍的时间比拟长，所以该检验方法需求一定的时间，且不可批量处置，所以医学范围不时对此停止了研讨，采用了自动化的培育和鉴定的器械，对传统的培育方式停止了改善，提升了检测的准确性。

3 组织细胞培育

组织细胞主要包括衣原体、病毒和立克次体等，由于不同的病原体内的组织细胞种类不同，所以从病原微生物中活体取出组织细后需采用传代培育的方式停止活细胞的培育，进而再讲培育的病原微生物接种到组织细胞中停止培育，以尽能够的增加细胞的病变。此外，也可以在培育组织细胞的进程中，可以将病原微生物直接在敏打植物体内接种，再依据植物的组织器官出现的改动对病原体的特质停止检验。

基因检测技术

随着我国医疗技术水平的不时提高，分子生物检测技术开展提高，其可以有效地对病原微生物停止鉴定，还可以改善传统检测进程中运用外部形状和生理特征停止检测的现状，可以采用特有的基因片段序列对病原微生物的种类停止鉴别，所以基因检测技术以其自身独到的优势被临床医学检验范围普遍运用。

1 聚合酶链反响（PCR）

聚合酶链反响(PolymeraseChainReaction，PCR)是一种在体外是用已知寡核苷酸引物引导未知片段中微量待测基因片段并停止扩增的技术。由于PCR可以看待测基因停止扩增，特别适用于病原体感染早期的诊断，但是假设引物特异性不强，能够会形成假阳性的出现。PCR技术在近20年里开展迅速，从基因扩增到基因的克隆和改造以及遗传剖析，牢靠性逐渐提高。该方法也是本次疫情新冠病毒的主要检测方法。

2 基因芯片技术

基因芯片(Gene chip)技术是指经过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段经过高速机器人或原位分解方式以一定的顺序或陈列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相外表，以同位素或荧光标志的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，停止少量的基因表达及监测等方面研讨的技术。将基因芯片技术运用到病原微生物的诊断中，可清楚延长诊断时间，同时还能检验出病原体能否存在耐药性，以及对哪些药物耐药，对哪些药物敏感等，从而为临床用药提供参考。但是该项技术的制形本钱较高，芯片检测的敏理性也需提高，所以该项技术还主要用于实验室研讨，未能在临床中失掉普遍运用。

3 核酸杂交技术

核酸杂交是病原微生物中具有互补序列的核苷酸单链在细胞内融合构成异质双链的进程，导至发作杂交的要素是核酸与探针发作化学反响，从而对病原微生物停止鉴定。目前用于对病原微生物停止检测的核酸再交技术主要有核酸原位杂交和膜上印迹杂交。核酸原位杂交是指病原体细胞中的核酸与标志探针停止杂交。膜上印迹杂交是指实验人员将病原体细胞的核酸分别出后，将其停止纯化后与固相支持物相结合，然后与核酸探针停止杂交。核酸杂交技术具有操作方便、快速的优点，而且适用于敏感、特异的病原微生物。

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相关指南共识

中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床运用专家共识

来源中华传染病杂志, 2020,38(11) : 681-689. DOI:10.3760/cma.j.cn311365-20200731-00732

共识有两种引荐建议：

引荐意见1：若疑心细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需停止二代测序检测时，建议采用DNA检测；若疑心RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测。

引荐意见2：关于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本停止二代测序。

高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床运用规范化专家共识

来源中华检验医学杂志, 2020,43(12) : 1181-1195. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200903-00704

血清学检测

采用血清学检测可以对病原微生物停止快速鉴定，血清学检测技术的基本原理是经过已知的病原体抗原以及抗体对病原体停止检测，与传统的细胞分别培育相比，血清学检验的操作步骤复杂，其常用的检测方法包括乳胶凝集实验和酶联免疫测试技术等。酶联免疫测试技术的运用可以大幅度提高血清学检测的敏理性和特殊性，不只可以对检测样本中的抗原停止检测，还可以检测抗体成分。

2020年9月，美国感染病学会（IDSA）发布了COVID-19的诊断之血清学检测指南。

感兴味的小同伴可以自行查阅，这里就不再详细引见。

免疫学检测

免疫学检测又被称为免疫磁珠分别技术，该技术可以将病原体中的致病菌和非致病菌分分开，其基本原理为：应用磁珠微球将特定病原体的单一抗原或许多种抗原集合在一同，经过抗原体反响和外部磁场的作用，将致病菌从病原体中分别出来，目前我国曾经研制出了多种具有针对性的免疫磁珠，例如有针对李斯特菌、大肠埃希氏菌和白色念珠菌等细菌的免疫磁珠，并且普遍运用于各级迷信研讨室

以及实验室。同时，采用经免疫磁珠分别技术对病原微生物停止检测所需求的时间段，例如，采用免疫磁珠分别技术分别出的白色念珠菌可以直接运用显微镜停止检测，可以有效延长 4 h 的检测时间。此外，免疫磁珠分别技术还可以与其他检测技术结合检测病原微生物。

病原体检测热点——呼吸道病原体检测

国际呼吸道病原体检测的热度逐渐升温，主要缘由为国际疫情迸发初期流感样症状患者混入新冠感染者，很难经过临床症状予以区分，所以事先发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》就指出：新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别，尤其是对疑似病例要尽能够采取包括快速抗原检测和多重PCR核酸检测等方法，对罕见呼吸道病原体停止检测。也因此，国际外的一些企业末尾减速布局，抢占风口。NMPA对相关试剂盒的同意也是创下新高，所以，这里小编给大家引见下疫情迸发之初到目前获NMPA同意的主要试剂盒及其企业信息（如需补充其他产品信息，请在留言区留言）：

援用：

[1] 云云, 汪长中, 吴璇. 病原微生物检测技术停顿[J]. 安徽医药, 2013, 17(003):501-503.

[2] 王洪. 怎样看待如今的病原微生物临床检验技术?.

[3] 佚名. 细菌与真菌涂片镜检和培育结果报告规范专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2017, 40(001):17-30.

[4] 《中华传染病杂志》编辑委员会. 中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床运用专家共识[本文附更正][J]. 中华传染病杂志, 2020, 38(11):681-689.

[5] [1] Hanson K E , Caliendo A M , Arias C A , et al. Infectious Diseases Society of America Guidelines on the Diagnosis of COVID-19:Serologic Testing[J]. Clinical Infectious Diseases, 2020.